Микроорганизмы существенно отличаются друг от друга по морфологии, размерам клеток, отношению к кислороду, по потребностям к ростовым факторам, способности ассимилировать разные компоненты субстрата и т. д.
Из более 100000 известных видов микроорганизмов в промышленности используют относительно мало – около 100 видов. Они должны соответствовать следующим требованиям:
1. Расти на дешёвых и доступных субстратах;
2. Обладать высокой скоростью роста биомассыи давать высокую продуктивность целевого продукта при экономичном потреблении питательного субстрата;
3. Проявлять направленную биосинтетическую активность при минимальном образовании побочных продуктов (рис. 2.1);

Рис. 2.1.Микроорганизмы, используемые в промышленном синтезе различных соединений
А – Аcetobacter aceti ; Б – Aspergillus niger ; В – Penicillium chrysogenum ; Г – Lactobacillus delbruecki ; Д – Производство левана при ферментации среды, содержащей Zymomonas mobilis

4. Быть генетически однородными, стабильными в отношении продуктивности и требований к питательному субстрату, а такжеусловиям культивирования;
5. Быть устойчивыми к фагам и другой посторонней микрофлоре;
6. Быть безвредными (не обладать патогенными свойствами) для людей и окружающей среды;
7. Желательно, чтобы продуценты были термофильными и ацидофильными, так как в этом случае легче предохранить ферментируемый субстрат от инвазии посторонней микрофлоры;
8. Целевой продукт биосинтеза должен иметь экономическую и народнохозяйственную ценность и легко выделяться из сброженного субстрата.
Возрастающий интерес представляют анаэробные микроорганизмы, поскольку при культивировании не требуют энергоёмких аэрирующих устройств.
Сверхсинтез, т. е. способность микроорганизма синтезировать определённый продукт в количествах, превосходящих его физиологические потребности, довольно часто встречается в природе. Нередко тот или иной продукт обмена веществ (органические кислоты, спирты, антибактериальные вещества), выделяемый микроорганизмом в окружающую среду, является токсичным для других видов и служит продуценту как средство защиты обитаемого пространства или как резерв питательного вещества. Микроорганизмы с такими свойствами первыми были привлечены к хозяйственной деятельности человека в тысячелетней давности и был проведён стихийный отбор наиболее продуктивных форм. Сейчас такие природные штаммы микроорганизмов, иногда после сознательного отбора, применяют для производства микробной биомассы (микробного белка) в качестве бактериальных азотных удобрений, биопестицидов, в производстве пищевых продуктов и в других отраслях народного хозяйства. Однако основной контингент промышленных микроорганизмов представлен искусственно селекционными штаммами.
В настоящее время впромышленности применяют три вида штаммов:
1. Природные штаммы, нередко улучшенные естественным или искусственным отбором;
2. Штаммы, изменённые в результате индуцированных мутаций;
3. Штаммы культуры, полученные методами генной или клеточной инженерии.
Принципы селекции организмов. Начиная сознательную селекцию микроорганизмов, человек ставил целью создать промышленные организмы с необычными для диких микробов свойствами. Методологически эту цель человек решает двумя путями:
1. Коррекцией генетической информации микробной клетки, исключая не желаемые для промышленного синтеза свойства и усиливая нужные признаки.
2. Индукцией совершенно новой информации в генетической программе клетки.
Для этого необходимо также решить следующие задачи:
1. Существенно увеличить продуктивность, свойственную данному виду микробов и его продукту обмена веществ;
2. Генетически запрограммировать биосинтез таких веществ, которые несвойственны данному виду или даже несвойственны микробному миру.
В отличие от селекции культурных растений и домашних животных, имеющей тысячелетнюю историю и богатый опыт, целенаправленный отбор и селекция микроорганизмов начались только после узнавания микромира и развивались параллельно с достижениями генетики как научной дисциплины.
Селекционируя любой живой организм, человек опирается на естественные движущие силы эволюции – наследственные изменения и отбор положительных экземпляров. Однако микроорганизмы, как объект селекции, имеют ряд особенностей:
1. Выращивание микробной культуры из одной клетки – обычный для микробной селекции приём – приводит к тому, что в руках селекционера в качестве исходного материала селекции всегда оказывается особь клона (имеющего генетическую однообразность). С другой стороны, клон микроорганизмов быстро достигает такой численности, что за счёт естественных мутаций превращается в популяцию – совокупность клеток с разными генотипами;
2. Большинство микроорганизмов гаплоидные, с одним экземпляром хромосом, поэтому у них нет скрытой изменчивости, являющейся основой селекции высших организмов;
3. У большинства микроорганизмов, имеющих промышленное значение, до сих пор не известна способность к гибридизации (половому размножению). Это означает, что селекцию клеток можно вести только вегетативным путём;
4. Микроорганизмы характеризуются исключительно быстрой сменой поколений, поэтому возможностей для отбора положительных экземпляров у селекционера микробиолога значительно больше. Оценку выбранного микроорганизма можно провести за считанные дни выращивания в отличие от макроорганизмов, где результаты работы видны через несколько лет;
5. Селекционер микроорганизмов имеет огромное число индивидуумов для отбора, что принципиально расширяет его возможности, но для оценки продуктивности каждого клона требуется трудоёмкая работа.
Культуру, подлежащую селекции, можно выбрать из собранных в коллекции культур (музейные культуры); можно использовать известные промышленные продуценты; можно изолировать микробы из природных субстратов.

Представления о биохимии и физиологии микроорганизмов ориентируют селекционера на определённые группы микроорганизмов с наиболее вероятным потенциалом сверхсинтеза интересующего вещества. Продуценты антибиотиков, главным образом, встречаются среди грибов аскомицетов и актиномицетов, сверхсинтез аминокислот легче получить у коринебактерий, внеклеточные ферменты часто синтезируют дрожжи. Главные этапы селекции микроорганизмов отражены на рисунке 2.2.

Рис. 2.2. Схема селекции микроорганизмов

Таблица 2.1. Группы методов клеточной технологии

Клеточная технология в селекции растений. Ускорение и облегчение селекционного процесса, а также создание растений с новыми качествами – это направления, которые достаточно успешно развиваются с помощью биотехнологических методов клеточной инженерии, культуры клеток и тканей.
Две группы методов, данной технологии, представлены в табл. 2.1.
Первые три, из указанных методов, стали традиционными, другие находятся на начальных этапах разработки. Наконец, есть такие методы, которые явно вышли из ранга вспомогательных, ускоряющих селекцию технологий. К ним можно отнести криосохранение генофонда – технологию, в настоящий момент приобретшую экологическую направленность; или клональное микроразмножение растений, тесно связанное с проблемой их оздоровления от вирусных и других инфекций.
Методы клеточной инженерии позволяют значительно ускорить традиционный процесс селекции. Биотехнология позволяет также скрещивать растения, которые в обычных условиях не скрещиваются рис. 2.2. – 2.6.
Одна из наиболее важных технологий, из перечисленных выше – оплодотворение in vitro , помогает предотвратить прогамную несовместимость , которая может быть вызвана рядом следующих причин:
1. Генетически детерминированное (определённое) несоответствие секрета рыльца материнского растения и пыльцы отцовского, которое тормозит рост пыльцевых трубок на рыльце пестика;
2. Несоответствие длины столбика пестика и пыльцевой трубки, в результате чего пыльцевая трубка не достигает семяпочки (гетеростилия);
3. Тканевая несовместимость партнёров, приводящая к остановке роста пыльцевой трубки в любой момент её прорастания, от рыльца пестика до микропиле семяпочки (гаметофитный тип несовместимости).
Преодоление прогамной несовместимости возможно благодаря выращиванию в стерильных условиях изолированной завязи с нанесённой на неё пыльцой или изолированных кусочков плаценты с семяпочками, рядом с которыми, или непосредственно на ткани которых, культивируется пыльца.
Значительным препятствием в селекции служит постгамная несовместимость , вызванная разновременным развитием зародыша и эндосперма при отдалённой гибридизации. В результате образуются невсхожие щуплые семена. Получить растение из таких семян можно только при использовании метода эмбриокультуры, т.е. выращивания изолированного зародыша на искусственной питательной среде in vitro. Метод эмбриокультуры широко применяют при межвидовой гибридизации овощных растений, для микроразмножения ценных гибридов, для клеточной селекции.
Большое значение имеет создание гаплоидов , позволяющее ускорить процесс селекции в 2-3 раза. Использование гаплоидных клеток и гаплоидных растений способствует обнаружению экспрессии введённого в клетку генома, редких рекомбинаций, рецессивных мутаций, которые в диплоидных растениях, как правило, маскируются доминантными генами. Из гаплоидных клеток можно выделить протопласты; сливаясь, они образуют гибридные клетки и растения с диплоидным числом хромосом. Обрабатывая гаплоидные клетки колхицином, можно добиться удвоения числа хромосом и получить диплоидные гомозиготные растения.

Методы создания дальнородственных гибридов

Большая часть медико-биологических исследований проводится на клетках in vitro (то есть, не на живом организме, а на клетках «в пробирке»). Клетки используют в качестве модельного биологического объекта в научных исследованиях, при тестировании и производстве лекарств. Кроме этого, ученые научились исправлять генетические ошибки в клетках и наделять их способностью противостоять некоторым заболеваниям, что служит основой для медицинских технологий будущего - генной и клеточной терапий. Эта статья расскажет о методах работы с клетками, а также о возможностях и ограничениях, связанных с их использованием.

Генеральный партнер цикла - компания : крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Партнер этой статьи -

Живой объект состоит из более мелких составных частей: органов, тканей, клеток, органелл, биомолекул и одновременно является частью более масштабных систем - таких как пищевые цепочки, экосистемы, сообщества. Еще Гиппократ и Аристотель задавались вопросом соотношения целого и его частей и сошлись в понимании, что целое есть больше, чем сумма частей. Однако современная наука почти полностью полагается на альтернативный принцип - редукционизм, - в соответствии с которым познание целого осуществляется через познание его составных частей. При таком подходе теряются связи между частями, в нашем случае - между клетками. Хотя каждая клетка есть тоже, по сути, целое, но вне организма это уже не совсем та клетка, что была в его составе. Что меняется при таком переходе?

Наглядной иллюстрацией служат слизевики . Эти одноклеточные обладают способностью объединяться из десятков тысяч клеток в плазмодий , который в поисках еды может быстро передвигаться и выбрасывать споры на большое расстояние, а потом вновь распадаться на отдельные клетки (видео 1). Многие бактерии тоже обладают способностью формировать плотные конгломераты - биофильмы, или биопленки, в которых внутренние клетки защищены внешними от окружающей среды. То есть объединение в многоклеточные структуры приводит к возникновению новых функций, отсутствующих у отдельных клеток. Конкурентные преимущества за счет приобретения новых способностей послужили причиной объединения одноклеточных организмов в многоклеточные около 1 млрд лет назад .

Видео 1. Dictyostelium discoideum - одноклеточный слизевик. Когда слизевики ищут еду, отдельные клетки объединяются и формируют плазмодий до 2 мм длиной.

В многоклеточных организмах клетки существуют в неразрывной связи друг с другом на протяжении сотен миллионов лет эволюции и за это время полностью перестроились на выполнение конкретных функций. Спектр экспрессируемых клеткой генов, ее функции и активность, форма и размер, скорость деления и гибель регулируются связями с другими клетками организма. У млекопитающих эта связь основана на всевозможных сигналах: химических (гормоны, цитокины, ростовые факторы, питательные вещества, производные кислорода, ионы металлов и др.), механических и электрических (передаваемых нейронами) (рис. 4).

Рисунок 4. Основные типы межклеточных взаимодействий. В составе организма клетки тесно связаны между собой, а их активность строго скоординирована. Для этого используются: электрические сигналы (сверху ), передаваемые нейронами, химические сигналы (посередине ), передаваемые через кровь (эндокринно) или межклеточную жидкость (паракринно), а также механические силы (снизу ). Эти связи существуют как между соседними клетками, так и между даже самыми удаленными клетками организма. Клетка преобразует поступающие сигналы в инструкции для изменения спектра активных генов, а следовательно, и свойств самой клетки.

Межклеточная коммуникация лежит в основе процессов, изучаемых почти всеми медицинскими дисциплинами, в частности эндокринологией, неврологией, кардиологией, гематологией и др., но о полной расшифровке этих взаимодействий пока говорить не приходится. Если у клетки в организме нарушаются нормальные связи с окружением, она либо умирает (для этого существуют специальные механизмы самоуничтожения - апоптоз и аноикис), либо становится «асоциальной», то есть раковой. При выделении из организма и переносе в чашку Петри клетки тоже теряют почти все внешние связи, но в благоприятных условиях некоторое время живут и делятся (однако могут стать и раковыми).

В новых, искусственных условиях клетки сохраняют лишь геном, а все остальные свойства меняются - размер, скорость роста, экспрессия генов, функциональная активность, чувствительность к лекарствам, метаболизм, состав мембран и другие. В связи с этим сегодня ведется активный поиск условий in vitro , которые максимально воспроизводят условия in vivo . Большинство тканей организма содержат несколько типов клеток, имеют сложную структуру внеклеточного матрикса и пронизаны сетью сосудов и нервов (рис. 5). Полностью воссоздать такую архитектуру in vitro пока невозможно, а значит, и клетки в культуре пока остаются лишь приближением к клеткам в составе организма.

Рисунок 5. Сложная организация соединительной ткани in vivo , состоящей из: нескольких типов клеток (фибробласты, жировые клетки, макрофаги и другие лейкоциты), нескольких типов волокон (1 - эластичные, 2 - ретикулярные и 3 - коллагеновые), нервов и сосудов, заключенных в гидрогель из полисахаридов.

Выделение и культивирование клеток

Источником клеток может быть любая ткань организма. В большинстве тканей клетки находятся внутри так называемого внеклеточного матрикса , который разделяет ткань на области и формирует ее архитектуру (рис. 5 и 6) . Внеклеточный матрикс состоит из белков, образующих фибриллы: коллагена, фибронектина, эластина и протеогликанов с длинными полисахаридными ветвями (гликозаминогликанами). Последние великолепно удерживают жидкость и формируют в бoльшей части внеклеточного пространства так называемый гидрогель. В случае кости матрикс формируется из кристаллизованного фосфата кальция . Самый распространенный из белков человека - коллаген: он составляет до 30% массы всех белков организма. Компоненты матрикса синтезируются многими клетками, но специализируются на этом фибробласты.

Рисунок 6. Как выглядят ткани под микроскопом: прижизненная мультифотонная микроскопия различных участков кожи, содержащих рыхлую (а ) и плотную (б ) соединительные ткани, мышечные (в ) и нервные волокна (г ), жировые клетки (д ) и микровезикулы (е ). Коллагеновые волокна изображены красным цветом (кроме в ), кровеносные сосуды - зеленым, клетки и микровезикулы - голубым (на б - зеленым). Шкала размера - 50 мкм. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

Для выделения клеток необходимо разрушить внеклеточный матрикс и разорвать связи между клетками, после чего клетки «рассыпаются» (рис. 7). Клеточную культуру можно получить и другим способом: поместив в культуральную среду кусок ткани целиком, и тогда часть клеток постепенно выползет и засеет окружающее пространство. Такой тип культуры называется эксплантом . Выделение и манипуляции с клетками обычно проводят в специальном стерильном боксе - ламинарном шкафу (рис. 8а ).

Рисунок 7. Схема выделения клеток из ткани. Фрагмент ткани, полученный прижизненно (биопсией) или после смерти, измельчают механически и обрабатывают протеолитическими ферментами, расщепляющими внеклеточный матрикс (трипсином, коллагеназой, гиалуронидазой, папаином или их комбинациями). В дополнение к ферментам используют кальций-связывающие соединения (хелаторы), которые забирают кальций у молекул клеточной адгезии и ослабляют их связь между собой и с внеклеточным матриксом. Добавление ДНКазы позволяет предотвратить склеивание клеток в тягучие сгустки за счет электростатических взаимодействий с высвободившейся из поврежденных клеток ДНК. После этого клетки отделяют от обломков матрикса (дебриса) центрифугированием и/или фильтрацией и высаживают в культуральные флаконы или чашки Петри.

У некоторых тканей нет внеклеточного матрикса или клетки не связаны с ним, что существенно упрощает процедуру выделения. Это относится, главным образом, к клеткам крови и их предшественникам, находящемся в костном мозге. Благодаря легкости выделения и сохранности поверхностных молекул для этих клеток наиболее хорошо изучено разнообразие типов и пути их формирования из стволовой клетки крови (гемопоэтической СК).

После выделения клетки помещают в питательную среду и растят в чашках Петри или флаконах в атмосфере углекислого газа (5% CO 2) и близкой к 100% влажности в CO 2 -инкубаторах (рис. 8б ). Питательная среда состоит из физиологических солей, буфера pH, аминокислот, витаминов и глюкозы, а также белковых ростовых и питательных факторов (см. врезку ниже). Добавляемый к среде индикатор феноловый красный позволяет визуально контролировать pH и придает среде красный цвет.

Рисунок 8а. Основное оборудование для культуральных работ - ламинарный шкаф. Ламинарный шкаф обеспечивает равномерный вертикальный поток стерильного воздуха, защищая культуру клеток от микробного заражения.

Рисунок 8б. Основное оборудование для культуральных работ - CO 2 -инкубатор. Углекислый газ в CO 2 -инкубаторе, во-первых, позволяет лучше воспроизвести условия in vivo , а, во-вторых, необходим для поддержания pH среды, в которой, как правило, используется бикарбонатная CO 2 -зависимая буферная система. В инкубаторе поддерживается близкая к 100% влажность, что предотвращает испарение жидкости и концентрирование ее компонентов.

Белковые ростовые и питательные факторы

Белковые факторы являются наиболее тонким местом при культивировании клеток. Самым распространенный источник этих факторов - сыворотка животных, обычно телячьих эмбрионов, реже лошадиная или из такого же животного, что и сами клетки. Клеткам добавляют цельную фильтрованную сыворотку с разбавлением до 1–10%. При исследовании действия каких-либо веществ на клетки (факторов роста, белковых гормонов, цитокинов) сыворотка создает сильный фон, который необходимо снижать, выращивая клетки без сыворотки (депривация) в течение 2–72 ч перед экспериментом. Использование сыворотки почти не поддается стандартизации и является потенциальным источником инфекций, что существенно ограничивает ее применение при производстве биомедицинских продуктов. Альтернатива сыворотке - белковые добавки стандартного состава из очищенных и рекомбинантных белков.

Проблемы культивирования и воспроизводимости в экспериментах с живыми клетками (решения от «Диаэм»)

Некоторые культуры очень чувствительны ко внешним воздействиям или колебаниям химического состава среды, в связи с чем возникает ряд вопросов:

• Как привести условия культивирования in vitro к условиям, сопоставимым с условиями in vivo ? Некоторые процессы, происходящие в живых организмах, требуют создания специальных условий (микроокружения) для клеток.
• Как организовать длительный эксперимент и вести наблюдение в динамике? Клеточные культуры - идеальный объект для постановки длительных экспериментов. Но возникает проблема гомеостаза окружающей среды: клетки постоянно потребляют питательные вещества и выделяют метаболиты. Если решать вопрос простой сменой культуральной среды, то концентрация веществ в среде между заменами будет не постоянной. Кроме того, культуру клеток придется регулярно вынимать из инкубатора, для того чтобы сменить среду или произвести наблюдение под микроскопом.
• Как обеспечить защиту культуры клеток от контаминации бактериями, микоплазмами и грибами, которые могут свести на нет все усилия по выделению клеток из тканей?
• Как добиться воспроизводимости эксперимента? Клетки - живые объекты, на поведение которых могут повлиять даже незначительные факторы: частое открывание дверцы инкубатора, разное время пребывания культуры вне инкубатора, освещение при наблюдении культур под микроскопом - все это может оказать существенное влияние на появление артефактов в эксперименте. Так что вторая задача - это добиться стабильности параметров эксперимента.

Решение:

Раковые клетки даже в организме сильно отличаются от нормальных, а в культуре это отличие только увеличивается. Так, многие раковые линии имеют увеличенный набор хромосом (анеуплоидия), что делает их более устойчивыми к повреждению ДНК. Кроме этого, многие типы раков вызваны вирусными инфекциями, передающимися и клеточным культурам, что не позволяет использовать эти клетки в производстве вакцин (см. ниже). В связи с этим в фармакологии и научных исследованиях широко востребованы линии «нормальных» - не раковых - клеток.

Именно производство вакцин послужило основным мотивом получения культуры «нормальных» клеток. С этой целью Леонард Хейфлик (рис. 10б ) выделял клетки из абортивного материала и обнаружил наличие предела числа делений клеток в культуре, получившего название предела Хейфлика . Для человеческих клеток этот предел составляет 50–70 делений и обусловлен укорочением теломер - фундаментальным механизмом старения клеток.

В 1965 году Хейфлик получил линию фибробластов легкого WI-38 (рис. 10а ), которая смертна, но была наработана и заморожена в достаточным количестве, чтобы обеспечить исследования по всему миру и по сегодняшний день . Благодаря человеческому происхождению, отсутствию вирусных инфекций и раковой трансформации эта линия нашла широкое применение в производстве вакцин. Сейчас, однако, фармкомпании опасаются, что конечный ресурс данной линии не позволит им завершить начатые исследования, и переходят на другие линии. В настоящее время эта линия широко используется для изучения молекулярных механизмов старения .

Некоторым компромиссом между раковыми и нормальными являются иммортализованные клетки: полученные из нормальной ткани, они приобрели способность к неограниченному числу делений. Такой переход к бессмертию может происходить либо спонтанно, либо в результате искусственного введения определенных генов или слияния с раковыми клетками, как в случае гибридoм . «Бессмертие» клеткам могут придать онкогены: большой Т-антиген вируса SV40, H-Ras, c-myc, E1A. Эти гены по сути вызывают опухолевую трансформацию клеток со всеми вытекающими недостатками (нестабильность генома, потеря физиологических функций и т.д.). Наиболее деликатный и получающий все большее распространение способ иммортализации - это введение в клетку гена теломеразной обратной транскриптазы (TERT) , которая достраивает теломеры и предотвращает их укорачивание при делении (рис. 11). За открытие теломеразы в 2009 году была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине .

Хотя такая трансдукция тоже является, по сути, онкогенной, она позволяет лучше сохранить физиологические функции и меньше дестабилизировать геном по сравнению с трансдукцией другими онкогенами. Также стоит отметить, что этот метод работает не для всех клеток: например, он не подходит для Т- и B-клеток.

Рисунок 11. Концевые участки хромосом - теломеры - укорачиваются при каждом клеточном делении, и при их истощении в клетке запускается механизм самоуничтожения. Теломеры у позвоночных состоят из повторяющихся последовательностей нуклеотидов TTAGGG. При каждом делении эти участки укорачиваются, но теломераза TERT предоставляет собственную одноцепочечную ДНК в качестве матрицы, с которой сама синтезирует сначала одну цепь, а потом ДНК-полимераза достраивает и вторую цепочку ДНК теломер. Таким образом теломераза способна поддерживать бессмертие клеток.

Дифференцированные клетки (которые приобрели свою конечную специализацию) составляют бoльшую часть клеток организма и практически не делятся. Будучи основными составляющими и «рабочими лошадками» во всех органах и тканях, они служат мишенью действия большинства лекарств, что делает их весьма востребованными для исследований. В культуре их можно получить путем направленной дифференцировки плюрипотентых стволовых клеток в нужный тип клеток (см. далее), однако этот путь имеет существенные технические и, в случае человеческих клеток, еще и этические сложности.

Наиболее распространенными культурами дифференцированных клеток являются первичные клеточные культуры - клетки, выделенные из зрелой ткани и не пассированные in vitro (рис. 12). Число делений таких клеток критически зависит от условий культивирования, но редко составляет более 5–10 раз. Исключением являются стволовые, прогениторные и некоторые специализированные клетки, например, активированные Т- и B-лимфоциты. Кроме того, при длительном культивирование первичная культура склонна к замещению фибробластами.

Многие исследования выполняются именно на первичных клеточных культурах, обладающих рядом преимуществ по сравнению с раковыми и иммортализованными клетками:

1. Они гораздо лучше соответствуют клеткам in vivo : нейроны проводят электрические импульсы, гепатоциты секретируют альбумин, макрофаги фагоцитируют бактерии и т.д.
2. Если говорить о клетках животных, они легко доступны при наличии вивария - остается лишь получить их (что, впрочем, довольно трудоемко). Доступность человеческих клеток определяется типом ткани: распространены культуры эндотелиальных клеток из пуповинной вены (HUVEC, рис. 12г) и мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани, источниками которых служат побочные продукты акушерства и хирургии соответственно.
3. Они несут генотип донора, а поэтому могут использоваться для изучения причин патологий конкретного пациента на молекулярном уровне.

Культуры клеток человека, мыши, крысы, кролика и других животных собраны в коллекциях, хранящихся в жидком азоте при температуре −196 °C (рис. 13а ). Наиболее полная коллекция - ATCC в США - насчитывает более 4600 клеточных культур эукариот. В МГУ сейчас создают уникальный по своим масштабам депозитарий живых систем «Ноев ковчег» , в котором среди всевозможных образцов живых объектов есть и клетки животных и человека (рис. 13б ). Некоторые институты тоже имеют свои коллекции: например, в ИБХ РАН коллекция организована по принципу облачного хранилища с общим журналом и клетками, распределенными по разным лабораториям.

Линии клеток из коллекций можно купить; они существуют почти для каждого типа опухоли и здоровой ткани и детально охарактеризованы. Это позволяет подобрать наиболее подходящие для конкретного исследования линии и сравнивать результаты с полученными ранее в своей или в других лабораториях.

«Диаэм»: все что нужно для работы с культурами клеток

Оборудование для клеточных технологий:

Культуральный пластик, среды, сыворотки, заменители, добавки:

Материал предоставлен партнёром - компанией «Диаэм»

Использование клеток в научных исследованиях

Клеточные культуры являются прежде всего инструментом для научных исследований. Какие возможности дает этот инструмент и для чего его можно использовать? Для клеток в культуре имеется богатый арсенал методов манипуляции и анализа: некоторые входят в 12 методов настоящего спецпроекта , а о многих других рассказывают отдельные статьи на «Биомолекуле». Здесь мы кратко остановимся на основных, но перед этим обсудим уникальные преимущества клеточных культур как модельных объектов.

В отличие от клеток в организме, для клеток в культуре исследователь полностью определяет внешние условия. Хотя эти условия часто и не соответствуют условиям in vivo , воспроизводимость и контроль позволяют ставить точные эксперименты и выявлять ответ клеток на определенные стимулы. Для изучения внутриклеточных процессов эта возможность уникальна, но надо помнить, что, чем сильнее клетки в культуре отличаются от клеток в организме, тем больше вероятность, что механизмы этих процессов тоже будут отличаться.

В клетке находится отнюдь не разбавленный раствор, используемый в биохимических и структурных исследованиях, а очень плотное и насыщенное микроокружение (crowded environment ) (рис. 14 и видео 2). Как следствие, активности молекул в искусственном растворе и «в жизни» иногда отличаются на несколько порядков. Именно поэтому клетка является гораздо более адекватной моделью при изучении активностей и взаимодействий биомолекул и при анализе воздействия потенциальных лекарств на молекулы-мишени в фармакологии.

Видео 2. Трехмерная реконструкция различных внутриклеточных структур в срезе из рисунка 14. подпись

Желтый - эндоплазматический ретикулум, синий - мембранно-связанные рибосомы, оранжевый - свободные рибосомы, светло-зеленые нити - микротрубочки, голубой - плотные коровые везикулы, белый - клатрин-негативные везикулы, светло-красный - клатрин-содержащие везикулы, пурпурный - клатрин-негативные компартменты, полости со светло- и темно -зелеными внутренними и внешними поверхностями - митохондрии. Отдельные молекулы и комплексы малого размера не отображены.

Как доставить ген в клетку?

Если интересующая нас молекула - белок, то самый простой способ поместить его в клетку и изучить - это заставить его синтезироваться прямо «на месте», введя внутрь клетки ген этого белка. Существует множество методов доставки генов в клетки (рис. 15) , как на основе чисто физико-химических принципов (трансфекция ), так и с использованием вирусов в качестве носителя (трансдукция ).

Эффективность трансфекции существенно зависит от типа клеток и методики: для раковых и иммортализованных клеток это обычно 30–80%, однако для первичных клеток - редко более 10%. Исключением является метод электропорации, который иногда позволяет добиться высокой эффективности доставки генов в первичные культуры. Химические методы трансфекции не предназначены для встраивания введенного гена в геном клетки, и со временем введенная ДНК теряется .

Небольшая доля ДНК все-таки может закрепиться в геноме при трансфекции и передаваться по наследству, что позволяет получить линию со стабильной экспрессией введенного гена. Отбор ведется путем селекции таких клеток по устойчивости к антибиотику (вместе с исследуемым геном обычно вставляют и ген, обеспечивающий такую устойчивость) или с помощью нескольких циклов клеточной сортировки.

Рисунок 15. Методы трансфекции и трансдукции. Для внедрения гена в клетку необходимо преодолеть внешнюю мембрану. Чаще всего для этого используют наноразмерные комплексы ДНК с липидными везикулами (липофекция), полимерными носителями или кристаллами кальция, которые сами поглощаются клеткой. Также можно временно продырявить мембрану с помощью электрического разряда - электропорации. Для случаев, когда ген нужно ввести лишь в несколько клеток (например, при изучении единичных нейронов), используют метод микроинъекции. В случае трансдукции используют вирусные частицы, в которые вместо части их собственного генома помещен необходимый ген. При этом вирусы сохраняют способность проникать в клетки, эффективно доставлять ген до ядра и, в случае некоторых вирусов, встраивать его в ДНК клетки.

Методы вирусной трансдукции имеют ряд преимуществ перед трансфекцией: высокая эффективность в отношении первичных клеточных линий, возможность встраивания гена в геном, применимость in vivo и избирательность действия вирусов на определенные типы клеток и тканей.

Для трансфекции создают искусственные вирусные частицы, снаружи похожие на натуральные вирусы и проникающие в клетку по тем же механизмам. Но внутри вместо части собственной ДНК они несут нужные исследователю гены и лишены программы саморепликации (то есть, такие частицы не заразны). Сегодня широко применяется около десятка генно-инженерных конструктов на базе различных вирусов. Для изменения избирательности вирусных частиц они могут быть дополнительно модифицированы заданными поверхностными молекулами.

Отредактируй это

Сейчас возможности клеточных технологий выходят на новый уровень после недавнего прорыва в методах редактирования генома на основе системы CRISPR/Cas-9 . Методика уже активно используется, и в продаже имеются наборы для избирательного удаления определенных генов из клеток (генетический нокаут). Преимуществом CRISPR/Cas-9 является простота по сравнению с доступными прежде методами редактирования генома (цинковыми пальцами, TALEN) . С помощью CRISPR/Cas-9 можно не только удалять и выключать гены, но и менять их и восстанавливать. На CRISPR/Cas-9 сегодня возлагают большие надежды в лечении моногенных наследственных заболеваний .

Да будет свет

Относительная простота введения желаемых генов в клетки открывает доступ к богатым возможностям, пожалуй, самого мощного на сегодня инструмента молекулярной биологии - генетически кодируемых флуоресцентных белков . Они позволяют отслеживать отдельные клетки в организме и даже молекулы в клетках, окрашивать определенные органеллы, изучать межмолекулярные взаимодействия и конформацию белков, измерять концентрации вторичных посредников (Ca 2+ , H 2 O 2 , цАМФ, H + , АТФ/АДФ, НАДН и др.), визуализировать и определять активность различных белков .

Помимо этого, в последние пять лет широкое распространение получила оптогенетика - метод, в котором с помощью генетически кодируемых светочувствительных белков можно управлять клеточными процессами с высоким временным и пространственным разрешением, буквально посветив в нужную область лазером (рис. 16) .

Рисунок 16. Оптогенетические конструкции позволяют с помощью лазера в заданной точке клетки и в заданное время запускать всевозможные процессы: 1 - ток ионов через мембрану и электрические импульсы, 2 - активность генов, 3 - активность белков, 4 - активность рецепторов и передачу сигналов в клетки, 5 - поглощение веществ снаружи, 6 - взаимодействия между белками, 7 - перемещение внутриклеточных везикул, 8 - синтез и деградацию белков, 9 - дыхательную цепь митохондрий и гибель клетки, 10 - передачу сигнала вторичными посредниками.

Флуоресцентные белки и оптогенетика проявляют весь свой потенциал в связке с современными методами флуоресцентной микроскопии . Эти методы достигли чувствительности единичных молекул при пространственном разрешении в несколько десятков нанометров, а при временнoм - до нескольких десятков микросекунд (рис. 17). Хотя такое пространственное разрешение и ниже, чем у электронной микроскопии, наличие временнoго разрешения (то есть применимость к живым клеткам) и возможность анализировать одновременно несколько молекул делают методы оптической микроскопии уникальными для широкого круга задач.

Рисунок 17. Пространственное и временнoе разрешение современных методов оптической микроскопии высокого разрешения. Обозначения: FRET - Forster resonant energy transfer (Фёрсторовский резонансный перенос энергии ); SPT - single particle tracking (микроскопия траекторий единичных частиц); PALM/STORM - photoactivation localization microscopy/stochastic optical reconstruction microscopy (фотоактивированная локализационная микроскопия/микроскопия стохастической оптической реконструкции); STED - stimulated emission depletion (микроскопия подавления стимулированного испускания ); FCS - fluorescence correlation spectroscopy (флуоресцентная корреляционная спектроскопия); TIRF - total internal reflection (микроскопия полного внутреннего отражения); SIM - structured illumination microscopy (микроскопия структурированного освещения); - confocal microscopy (конфокальная микроскопия).

Типирование и сортировка

Еще одним мощным методом, который применим только к клеткам in vitro и ex vivo (сразу после выделения), является проточная цитометрия - поштучное исследование клеток в потоке жидкости: клетки по одной проходят через луч лазера, а специальные детекторы ловят сигнал флуоресценции и светорассеяния от освещенной лазером клетки. В отличие от микроскопии, она является исходно количественным методом, то есть позволяет точно измерить интенсивность флуоресценции и обладает высокой производительностью: скорость обработки достигает миллиона клеток в минуту. Это позволяет проводить «перепись» гетерогенных клеточных популяций, коими являются все первичные клеточные культуры. В частности, ей нет альтернатив при идентификации, подсчете и сортировке редких в популяции клеток, таких как стволовые клетки или антиген-специфичные лимфоциты, которых может быть лишь несколько клеток на миллион. Наибольшее распространение цитометрия нашла в иммунологии для анализа субпопуляций лейкоцитов без перевода их в культуру. Важной разновидностью цитометрии является клеточная сортировка в потоке, которая позволяет не только анализировать, но и выделять отдельные субпопуляции из гетерогенных клеточных смесей с чистотой более 99%.

От клеток к организму с помощью стволовых клеток

До этого мы рассматривали традиционные методы работы с клетками, многие из которых предложены во второй половине прошлого столетия. В то время это были передовые технологии, которые впоследствии внесли существенный вклад в развитие биомедицинской науки и молекулярной биологии, а сейчас являются частью обыденной лабораторной практики. Сегодня передовые клеточные технологии позволяют достичь впечатляющих результатов. Однако в научных и, в особенности, научно-популярных статьях авторы часто склонны преувеличивать масштаб открытия и замалчивать сложности и ограничения. Это создает несколько искаженную картину, в которой уже сегодня где-то есть врачи, которые печатают органы на 3D-принтере, избавляют людей от ВИЧ и слепоты и способны вылечить практически любой рак. Действительно, успехи клеточных технологий позволяют надеяться, что это и правда станет возможным в будущем, но пока ведущие специалисты призывают не торопиться с прогнозами, поскольку организм и ткань гораздо сложнее, чем просто сумма составляющих клеток.

Эмбриональные стволовые клетки

Рисунок 20а. Стимуляция формирования эмбриоидных телец в подвешенных каплях.

Рисунок 20б. Культивирование клеток в камере Максимова. В ней капля с кусочком ткани или клетками помещается на малое покровное стекло. С помощью капельки воды и капиллярных сил малое покровное стекло адгезируется к большому, которое, в свое очередь, кладется на основание и герметизируется парафином.

Справочная информация по работе с культурами клеток от «Диаэм»

Хотите узнать больше о тонкостях работы с культурами клеток или увидеть, как организована клеточная лаборатория?

Дополнительная информация по теме «Клеточные технологии».

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГБОУ ВПО

«Оренбургский государственный аграрный университет»

Кафедра технологии хранения и переработки с/х продукции

Реферат на тему:

«Клеточная биотехнология в растениеводстве»

Выполнила:

студентка агрономического

факультета гр. № 21Туманина Я.Д.

Проверила:

Гарипова Р.Ф

Оренбург 2015

Введение

2. Культура каллусных тканей

Заключение

Список литературы

Введение

Биотехнология - наука о генно-инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных биологических объектов для интенсификации производства и получения новых видов продуктов различного назначения.

В рамках науки биотехнологии можно выделить 3 основных части:

1. Промышленная биотехнология, где рассматриваются общие принципы осуществления промышленных биотехнологических производств, использующих микроорганизмы. Микробиологическая промышленность в настоящее время использует тысячи штаммов различных микроорганизмов. Некоторые белки и вторичные метаболиты могут быть получены только путем культивирования клеток эукариот. Растительные клетки могут служить источником ряда соединений - атропин, никотин, алкалоиды, сапонины и др. Клетки животных и человека также продуцируют ряд биологически активным соединений. Например, клетки гипофиза - липотропин и соматотропин.

2. Клеточная инженерия - культивирование растительных и животных клеток. Клеточная биотехнология обеспечила получение новых форм и линий растений и животных, используемых в селекции на устойчивость, продуктивность и качество. Например, созданы перевиваемые культуры клеток животных, продуцирующие моноклональные антитела, широко применяемые для диагностики заболеваний. В ветеринарии широко используются культура клеток и зародышей, овогенез in vitro, искусственное оплодотворение.

3. Генная инженерия - перенос чужеродных генов и других материальных носителей наследственности в клетки растений, животных и микроорганизмов, получение трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками. Позволяет решать коренные задачи селекции биологических объектов на устойчивость, высокую продуктивность и качество продукции при оздоровлении экологической обстановки во всех видах производств.

Клеточная биотехнология базируется на использовании культуры клеток, тканей и протопластов. Для того чтобы манипулировать клетками, нужно выделить их из растения и создать такие условия, при которых они могли бы жить и размножаться вне растительного организма. Метод культивирования изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получил название культуры изолированных тканей и приобрел особое значение в связи с возможностью использования его в биотехнологии.

1. Культура клеток и тканей высших растений

биотехнология клетка растение гаплоидный

Культуры клеток высших растений имеют несколько сфер применения:

1. Получение биологически активных веществ растительного происхождения: традиционных продуктов вторичного метаболизма (токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов); синтез новых необычных соединений, что возможно благодаря исходной неоднородности клеточной популяции, генетической изменчивости культивируемых клеток и селективному отбору клеточных линий со стойкими модификациями, а в некоторых случаях и направленному мутагенезу; культивируемые в суспензии клетки могут применяться как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ;

2. Ускоренное клональное микроразмножение растений, позволяющее из одного экпланта получать от 10000 до 1000000 растений в год, причем все они будут генетически идентичны.

3. Получение безвирусных растений.

4. Получение культуры пыльников и пыльцы используются для получения гаплоидов и дигаплоидов;

5. Тканевые культуры могут производить регенеранты, фенотипически и генотипически отличающиеся от исходного материала в результате сомаклонального варьирования.

История метода

1 этап. Карл Рехингер (1893) выращивал тонкие срезы корня свеклы и одуванчика и сегменты стебля тополя на песке с применением водопроводной воды, без стерильных условий. Г. Габерланд (1902) научился культивировать отдельные зеленые клетки волосков традесканции вирджинской.

2 этап. Гаррисон вырастил нейробласты лягушки в лимфатической жидкости, доказав возможность выращивания in vitro изолированных клеток.

3 этап. В 1922 г. Коттэ начал эксперименты с лишенными пигментов меристематическими тканями - изолированными кончиками корней. Роббинс подобрал состав питательной среды, обеспечивающий в культуре рост апикальной меристемы корня томатов и кукурузы. Эти опыты положили начало культивированию изолированных органов растений на питательных средах.

4 этап. Ф. Уайт и Р. Готре показали, что изолированные органы и ткани могут расти в культуре неограниченно долгое время, если их пересаживать на свежую питательную среду. Были разработаны составы питательных сред, изучено значение микро- и макроэлементов для поддержания нормальной ростовой активности тканей, определено влияние витаминов и стимуляторов роста. Показано значение кинетина и других гормонов для пролиферации клеток in vitro и индукции стеблевого морфогенеза. Изучением этих вопросов занимались такие ученые, как Р. Хеллер, И. Нич, Ф. Скуг, Ф. Стевард, Р. Г. Бутенко.

5 этап. Э. Коккинг в 1960 - 1975 гг. положил начало методу получения изолированных протопластов из тканей корня и плодов томатов. Были разработаны методы гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов и введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, бактерий. Ведутся работы по переносу генов в растительные клетки и получению трансгенных растений.

Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности. Богатая питательная среда является прекрасным субстратом для развития в ней микроорганизмов, а изолированные от растения фрагменты (экспланты), которые помещают на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами. Поэтому надо стерилизовать как эксплант, так и питательную среду. Все манипуляции с изолированными тканями (введение в культуру, пересадка на свежую питательную среду) проводят в асептическом помещении (ламинар-боксе) стерильными инструментами. Стерильность надо соблюдать и во время культивирования изолированных тканей, особенно при перепаде температуры и влажности, так как при этом пробки становятся влажными и по ним в пробирку могут проникать микроорганизмы.

Стерилизацию экспланта, а также семян проводят путем выдерживания их 5--20 мин в стерилизующих растворах с последующей многократной промывкой экспланта стерильной водой. Время стерилизации зависит от характера экспланта и от стерилизующей активности раствора. Обычно семена стерилизуют 10--20 мин, а вегетативные части 5--10 мин. Органы растений, из которых берут эксплант для введения в культуру, предварительно моют мыльным раствором с щеткой и споласкивают дистиллированной водой, а затем погружают на несколько секунд в 70 %-ный этанол. Семена погружают в спирт на 1--2 мин. Кроме собственно стерилизующего действия спирта обработка тканей этанолом перед помещением в основной стерилизующий раствор повышает стерилизующий эффект последнего.

После стерилизации растительные объекты должны быть тщательно промыты стерильной водой.

Поверхностная стерилизация освобождает эксплант только от наружной инфекции. Если же ткани экспланта имеют внутреннюю инфекцию, то его необходимо обработать антибиотиками. Особенно богаты внутренней инфекцией ткани тропических и субтропических растений, имеющих крупные сосуды. Загрязнение культур грибами или бактериями обычно выявляется через 1 --14 дней после посадки. Загрязненные культуры необходимо тотчас же удалить, чтобы избежать заражения воздуха в световой комнате.

Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120° С и давлении 0,75--1 атм в течение 20 мин.

Если в состав питательной среды входят вещества, разрушающиеся при высокой температуре, их подвергают холодной стерилизации, пропуская через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,22--0,45 мкм, после чего добавляют в проавтоклавированную охлажденную до 40° С основную среду.

Посуду, предварительно завернутую в фольгу или оберточную бумагу, стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160° С в течение двух часов.

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы (азот, фосфор, калий, кальций, магний, серу, железо) и микроэлементы (бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также витамины, углеводы, фитогормоны или их синтетические аналоги. Некоторые питательные среды содержат гидролизат казеина, аминокислоты. Кроме того, в состав питательных сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, которые улучшают доступность железа для клеток.

Для получения каллусной ткани в отдельных случаях к питательной среде добавляют жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана и др.

2. Культура каллусных тканей

Культура изолированных тканей обычно бывает представлена каллусными или реже -- опухолевыми тканями. Каллусная культура -- это неорганизованная пролиферирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. В дальнейшем они специализируются как каллусные, т.е. становятся особым образом дифференцированными. Каллус, что означает «мозоль», может образовываться как на изолированных кусочках ткани (эксплантах) in vitro, так и на растении при поранении.

Каллусная ткань in vitro в основном бывает белого или желтоватого, реже светло-зеленого цвета. Очень редко она может иметь интенсивную зеленую окраску (у мандрагоры). Темно-коричневая окраска возникает чаще при старении каллусных клеток и связана с накоплением в них фенолов. Последние окисляются в хиноны. Для избавления от них в питательные среды вносят антиоксиданты.

Каллусная ткань аморфна и не имеет конкретной анатомической структуры, но в зависимости от происхождения и условий выращивания она может быть разной консистенции: 1) рыхлой, состоящей из сильно оводненных клеток, легко распадающейся на отдельные мелкие агрегаты; 2) средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами; 3) плотной, в которой дифференцируются элементы камбия и проводящей системы.

Нормальные клетки в культуре могут существовать в двух видах: в виде суспензии в жидкой питательной среде и на поверхности твердой питательной среды в виде каллуса.

В основе культивирования растительных клеток лежит свойство тотипотентности, благодаря которому соматические клетки растения способны полностью реализовать наследственную информацию, то есть обеспечить развитие всего растения. Следует отметить, что в отличие от животной, растительная клетка предъявляет менее жесткие требования к условиям культивирования. Изменяя условия (добавляя в состав питательной среды те или иные гормоны), можно вызвать дифференциацию недетерминированных клеток.

Условия культивирования. Для успешного культивирования изолированных клеток и тканей растений необходимо соблюдать определенные условия выращивания. Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как не имеют хлоропластов и питаются гетеротрофно. Исключение составляют некоторые зеленые каллусные ткани, такие, как каллусная ткань мандрагоры. В некоторых случаях каллусные ткани, не способные к автотрофному питанию, все же выращивают на непрерывном освещении, что является необходимым условием дальнейшего успешного морфогенеза, как у люцерны. Большинство же каллусных тканей получают в темноте или при рассеянном свете.

Детерминированные к морфогенезу ткани переносят на свет и далее культивируют их при освещенности 1000--4000 лк.

Культивирование изолированных меристем и их микроразмножение также происходит на свету. Освещенность факторостатной (световой) комнаты должна составлять в зависимости от культуры 1000--10 000 лк. Необходимо учитывать фотопериод, который требуется для данного культивируемого объекта.

Влажность в культуральной комнате должна составлять 60--70%. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, если они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации и нарушению условий культивирования. Для повышения влажности в комнате можно использовать поддоны с водой.

Оптимальная температура для большинства культивируемых тканей 25--26° С, для культуры тканей тропических растений она может достигать 29--30° С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18--20° С.

Наилучшие световой и температурный режимы, а также режим оптимальной влажности можно создать с помощью климатических камер.

Основным типом культивируемой растительной клетки является каллус. Каллусная ткань - один из видов клеточной дифференцировки, возникает путем неорганизованной пролиферации дедифференцированных клеток органов растения. У растений в природе каллусная ткань возникает в исключительных обстоятельствах (например, при травмах) и функционирует непродолжительное время. Эта ткань защищает место поранения, может накапливать питательные вещества для анатомической регенерации или регенерации утраченного органа. Процессу образования каллуса предшествует дедифференцировка тканей экспланта. При дедифференцировке ткани теряют структуру, характерную для их специфических функций в растении, и возвращаются к состоянию делящихся клеток. Если эксплант, используемый для получения каллуса, является фрагментом органа, то имеет в своем составе эпидермальные клетки, клетки камбия, сосудистой системы, сердцевинной и первичной коровой паренхимы. Преимущественно пролиферируют клетки камбия, коры, сердцевинной паренхимы.

Морфофизиологическая характеристика каллусных тканей

Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают:

Рыхлые, сильно оводненные, легко распадающиеся на отдельные клетки;

Средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;

Плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов.

Как правило, в длительной культуре на средах, содержащих ауксины, каллусные ткани теряют пигментацию и становятся рыхлыми.

В цикле выращивания каллусной ткани клетки после ряда делений приступают к росту растяжением, дифференцируются как зрелая каллусная ткань и деградируют. Для того, чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и дальнейшему росту, а также отмирания каллусных клеток, первичный каллус переносят на свежую питательную среду через 28 - 30 дней, то есть проводят пассирование или субкультивирование каллусной ткани. При пассировании ткани на среду, содержащую индукторы органогенеза, мелкие клетки приступают к делению и формируют меристематические очаги. Деление клеток меристематического очага приводит либо к формированию почек и последующему развитию из них побегов (геммогенез), либо к ризогенезу. Возникновение физиологических и структурных различий между клетками и тканями растений, связанное с их функциональной специализацией, называют процессом дифференциации. Понятие «дифференциация» отражает превращение эмбриональной, меристематической клетки в специализированную.

3. Суспензионные культуры и культуры гаплоидных клеток растений

Суспензионные культуры

Суспензионные культуры - отдельные клетки или группы клеток, выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко подвергнуть воздействию химических веществ.

Суспензионные культуры широко используются в качестве модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов, деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др.

Признаком "хорошей" линии служит способность клеток к перестройке метаболизма и и высокая скорость размножения в конкретных условиях культивирования.

Морфологические характеристики такой линии:

· высокая степень дезагрегации (5-10 клеток в группе);

· морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма);

· отсутствие трахеидоподобных элементов. Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с жидкой питательной средой.

Культуры гаплоидных клеток растений

Большой интерес для селекционеров представляют гаплоидные растения. Гаплоиды получают:

Методом отдаленной гибридизации, когда в зиготе отдаленного гибрида хромосомы одного из видов элиминируют.

Культивирование in vitro, где из неоплодотворенных половых клеток с редуцированным набором хромосом можно регенерировать целые растения. Обычно они стерильны, так как у них нарушено формирование мужских и женских гамет. При культивировании in vitro, однако, может произойти спонтанное удвоение хромосом, или его можно вызвать искусственно, например, обработав колхицином клетки или растения. Дигаплоиды фертильны и вполне жизнеспособны.

Гаплоиды и дигаплоиды имеют ряд преимуществ в селекционной работе:

· гаплоидные растения имеют один набор хромосом, характерный для гамет, что дает возможность наблюдать мутации сразу же в ходе осмотра гаплоидных растений, поскольку все рецессивные генные мутации в гаплоидных организмах не маскируются доминантными аллелями;

· если гаплоидные клетки подвергнуть полиплоидизации с помощью колхицина, то возникнут дигаплоиды, характеризующиеся абсолютной гомозиготностью. Скрещивание гомозиготных линий дает, как правило, высокопродуктивное потомство;

Наиболее распространены следующие методы индуцирования гаплоидов:

1. индуцированный андрогенез в культуре пыльников и пыльцы. Впервые гаплоидные растения были получены в 1964 году индийскими исследователями С. Гуха и С. Махешвари при культивировании пыльников дурмана. С тех пор таким методом получены гаплоидные растения более чем у 200 видов, в том числе у пшеницы, ячменя, ржи, риса, картофеля и других культур. Культура пыльцы представляет собой культивирование микроспор, освобожденных от соматических тканей пыльника, в жидкой среде.

2. селективная элиминация хромосом в гибридном зародыше. Этот метод чаще всего используется в селекции злаковых. При отдаленной гибридизации некоторых видов установлено явление селективной элиминации хромосом одного из родителей на ранней стадии развития гибридного зародыша. Это явление хорошо изучено у ячменя. При скрещивании диплоидных ячменей Hordeum vulgare (культурный) и H. bulbosum (многолетний луковичный дикий) на стадии роста зародыша и эндосперма (через 5 дней после оплодотворения) происходит выпад хромосом дикого вида. Возникает гаплоид с набором хромосом H. vulgare.

3. псевдогамия - развитие гаплоидного зародыша после оплодотворения инородной пыльцой без оплодотворения яйцеклетки или же развитие изолированной семяпочки (гиногенез).

4. Клональное микроразмножение растений

В природе существует два способа размножения растений: половой (семенной) и вегетативный. Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения - клонального микроразмножения.

Клональное микроразмножение - получение in vitro, неполовым путем, генетически идентичных исходному экземпляру растений. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность.

Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

· получение генетически однородного посадочного материала;

· освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;

· высокий коэффициент размножения (105 - 106 - для травянистых, цветочных растений, 104 - 105 - для кустарниковых древесных растений и 104 - для хвойных);

· сокращение продолжительности селекционного процесса;

· ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;

· размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами; · возможность проведения работ в течение всего года;

· возможность автоматизации процесса выращивания.

Пионером клонального микроразмножения считается французский ученый Жан Морель, который в 50-х годах двадцатого века получил первые растения-регенеранты орхидей.

Этапы микроклонального размножения растений

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.

3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2оС, +10оС).

4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики. На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.

2 этап - собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.

Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов--ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.

При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5--10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией.

3 и 4 этапы - укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5--1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют в-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК.

Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов.

Заключение

Использование культур клеток и тканей во многих работах позволяет проводить параллели между процессами invitro и invivo, моделировать и изучать метаболические процессы вне организменного контроля. Эти системы могут быть использованы как альтернатива природным источникам получения практически ценных соединений, в частности как модель биосинтеза и биогенетических связей в ряду вторичных метаболитов. Много работ проводилось в сфере изучения влияния различных факторов и химических агентов на биохимические и морфологические процессы в культуре тканей и клеток, с последующим переносом этих знаний на природные объекты. С помощью моделей invitro возможно исследование геномных и хромосомных аббераций, изучение роли экзо- и эндофитогормонов (эксперименты по изменению и подбору питательных сред) на характеристики роста и развития растений.

Таким образом, культура клеток растений имеет огромное как практическое, так и фундаметально-научное значение. Безусловно, данный метод будет использоваться и модифицироваться, как удобный инструментбиотехнологической, биохимической и других категорий исследовательской деятельности.

Список литературы

1. Алёхина Н.Д., Балконин Ю.В., Гавриленко В.Ф. Физиология растений М.: Академия, 2005. С. 416-498, 588-593.

2. Сорокина И.К., Старичкова Н.И., Решетникова Т.Б., Гринь Н.А. Основы биотехнологии растений. Культура растительных клеток и тканей. Учебное пособие М.: УМК биологического факультета СГУ им. Н.Г.Чернышевского, 2002. 45 с.

3. Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Дегтярев С.В. Сельскохозяйственная биотехнология М.: Высшая школа, 1998. С. 7 - 66.

4. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков М.: Мир, 1983. С. 16.

5. Носов А.М. Культура клеток высших растений - уникальная система, модель. Физиология растений. 1999. Т. 46. №6. С. 837 - 844.

Размещено на Allbest.ru

...

Подобные документы

Биотехнология на страже урожая. Биотехнологические аспекты борьбы с возбудителями болезней растений и вредными насекомыми. Получение растений-регенерантов, устойчивых к абиотическим и биотическим стрессовым факторам методами клеточной инженерии.

реферат , добавлен 22.08.2008


Составной частью биотехнологии является генетическая, или генная инженерия. Методы генетической инженерии. Биотехнология базируется на принципах традиционной селекции, заключающихся в приобретении организмами необходимых качественно новых признаков.

реферат , добавлен 24.01.2009


Краткая история развития метода культуры ткани. Терминология клеточных культур. Требования к факторам внешней среды. Питательные среды, солевые растворы. Материалы для приготовления культуры клеток из кожно-мышечной ткани развивающихся куриных эмбрионов.

курсовая работа , добавлен 16.03.2014


Иммунная система рыб представляет собой совокупность клеточных и гуморальных факторов иммунитета и состоит из клеток лимфоидно-макрофагального комплекса (лимфоцитов, гранулоцитов, клеток Купфера, Лангерганса и т.д.).

методичка , добавлен 03.07.2007


Сведения о беспозвоночных вредителях культурных растений и их распространении на различных культурах. Анализ повреждаемости растений на агробиостанции. Средства борьбы: карантин растений, агротехнический, механический, биологический и химический методы.

курсовая работа , добавлен 05.06.2011


Основные направления в интегрированной системе защиты растений как средство повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Роль интегрированной защиты растений в охране окружающей среды. Классификация методов, принципы проведения защиты растений.

реферат , добавлен 23.03.2012


Агрохимия – наука о взаимодействии растений, почвы и удобрений в процессе выращивания сельскохозяйственных культур. Цель агрономической химии – создание наилучших условий питания растений. Общие сведения о хозяйстве ЗАО "Бобравское" Рокитнянского р-на.

курсовая работа , добавлен 22.03.2009


Описание основных инновационных научно-исследовательских разработок предприятия в области биотехнологии и их применение. Типы мутаций, причины их возникновения. Изменения признаков организма, вызываемые ими. Их значение для эволюции, селекции и медицины.

отчет по практике , добавлен 23.02.2015


Характеристика защищаемых культур и особенностей их возделывания. Морфологические и биологические особенности овощной культуры. Оценка экономической эффективности при применении пестицидов. Составление фенологического календаря по защите растений.

курсовая работа , добавлен 02.06.2014


Сущность, этапы, основные преимущества клонального микроразмножения. Адаптация растений к почвенным условиям произрастания. Выбор питательной среды и ее основные компоненты. Применение клонального микроразмножения для выращивания декоративных растений.

Клеточная селекция

Клеточная селекция основана на высокой изменчивости популяции соматических клеток, усилении изменчивости с помощью различных мутагенов и на разработке селективных систем, позволяющих выявить и отобрать генетически измененные клоны клеток (мутантные, рекомбинантные и др.). Благодаря свойству тотипотентности из этих клеток регенерируют целые растения.

Спонтанные мутации в популяции клеток наблюдаются редко, поэтому для повышения частоты мутаций используют индуцированный мутагенез. Получение мутантных форм при использовании селекции на клеточном уровне складывается из следующих этапов: 1) обработка мутагеном суспензии клеток или протопластов; 2) перенесение суспензии в селективные условия; 3) выделение развивающихся колоний; 4) отбор измененных резистентных к селективному фактору клонов; 5) индукции органогенеза; 6) регенерация измененных растений.

Методом клеточной селекции получены: линии кукурузы, устойчивые к гельминтоспориозу; линии картофеля: резистентные к фитофторе; растения табака, устойчивые к вирусу табачной мозаики. В культуре клеток получены мутанты с повышенным синтезом незаменимых аминокислот. Так, отобраны штампы клеток моркови и табака, синтезирующие в 20-30 раз больше свободного триптофана по сравнению с исходными родительскими культурами. Этим способом получен целый ряд клеточных линий картофеля, моркови, риса, способных к сверхсинтезу лизина, метионина, пролина, фенилаланина, глицина. Это реальный путь создания растений с повышенным содержанием аминокислот, особенно незаменимых. Используя различные селективные системы, можно вести направленную селекцию по различным хозяйственно-ценным признакам, как то устойчивость к гербицидам, болезням, к различным стрессовым воздействиям (засоление, затопление, низкие и высокие температуры и др.)

Для получения мутантов в каждом случае необходимо разработать схему селекции и доказать генетическую природу измененных клеточных линий. Полученные изменения не всегда бывают связаны с мутациями, а могут носить модификационный характер и не наследоваться. Доказательством мутации является совокупность следующих критериев: 1)частота спонтанно измененных клеток должна быть очень низка; 2) она значительно повышается при использовании мутагенов; 3) измененные клетки способны делиться и длительно расти; 4)стабильность измененного признака сохраняется и при отсутствии селективного давления; 5) обнаруживается продукт измененного гена (морфологические и биохимические маркеры).

Эффективность мутагена в культуре тканей повышается на гаплоидном уровне благодаря проявлению всех рецессивных мутаций в ранних поколениях, а также в культуре протопластов из-за их выравненности при изолировании из однородных тканей. Особенно перспективными источником выделения разнообразных мутаций являются протопласты гаплоидных растений.

Мутагенез и клеточная селекция как в случае соматических, так и половых клеток являются эффективными способами получения генетически измененных форм и новых сортов растений.

В результате генетической изменчивости in vitro возникают сомоклональные варианты – растения, отклоняющиеся от родительского типа. Сомоклональная вариабельность имеет несколько причин: перемещение подвижных генетических элементов, инверсии, траслокации, делеции, генные перестройки, связанные с дифференцировкой, соматической кроссинговер. Наследственная изменчивость в культуре клеток может иметь не только генетическую, но и эпигенетическую природу, то есть возникает вследствие изменения действия генов.

Особый интерес представляют сомоклоныльные варианты злаков как источник получения ценных генотипов. Получены линии пшеницы, ячменя, риса, варьирующие по таким очень консервативным признакам, как высота растений, длина остей, окраска зерна, формаколоса, электрофоретические спектры запасных белков. Сомоклональные варианты успешно используются как эффективный источник изменчивости для улучшения сортов сельскохозяйственных культур.

Биотехнология в растениеводстве - улучшение технологий в селекции растений

Современная биотехнология растений - сумма технологий, которые развиты по молекулярной и клеточной биологии растений, - новая стадия в развитии технологии селекции растений. С помощью этих технологий улучшения признаков может происходить на уровне индивидуального гена, а отдельные гены, определяющие определенную признак, могут быть идентифицированы. За ними может быть проведен отбор, их можно изолировать, ввести, удалить или модифицировать в генотипе растения или в сорте. Вклад биотехнологии в сельскохозяйственное производство заключается в облегчении традиционных методов селекции растений, разработке новых технологий, позволяющих повысить эффективность сельского хозяйства. Методами генетической и клеточной инженерии созданы высокопродуктивные и устойчивые против вредителей, болезней, гербицидов сорта сельскохозяйственных растений. Разработано технику оздоровления растений от накопления инфекций, что особенно важно для культур, которые размножаются вегетативно (картофель и др.). Одной из актуальных проблем является возможность управлять процессом азотфиксации, в том числе возможность введения генов азотфиксации в геном полезных растений, а также управления процессами фотосинтеза. Ведутся исследования по улучшению аминокислотного состава растительных белков, разрабатываются новые регуляторы роста растений , микробиологические средства защиты растений от вредителей и болезней, бактериальные удобрения. На современном этапе развития селекции для его интенсификации эффективное использование таких биотехнологических методов, как культура изолированных тканей, клеток и органов растений, клеточная селекция и генетическая инженерия, которые дают возможность за сравнительно короткие сроки создать и размножить ценный исходный высокопроизводительный материал, гетерозисных гибриды и сорта сельскохозяйственных растений. Разработка основ метода культуры тканей растительных организмов имеет сравнительно короткую историю и начинается с исследований, выполненных Габерландтом в 1902 г. Однако каждое открытие, сделанное в этой области, нашло применение в прикладных исследованиях.

Все проблемы, которые разрабатывают в культуре in vitro, можно разделить на три основные группы: n сохранения генетической информации клеток (микроклональное размножения растений и депонирования, культура зародышей, пыльников и семенных зачатков); n изменение генетической информации способом мутагенеза под влиянием физических и химических факторов (культура каллуса, клеточных суспензий, изолированных протопластов); n перенос и восстановление генетической информации (генно-инженерное конструирование растений с новыми признаками, соматическая гибридизация).

Одним из распространенных направлений метода культуры тканей является микроклональное размножения, при котором получают генетически идентичны формы, что способствует сохранению генетически однородного посадочного материала. Как эксплантатов можно использовать пазушные почки, молодые листья, некоторые элементы цветов и соцветий. Однако такой вид размножения требует конкретизации метода для каждой сельскохозяйственной культуры в связи с особенностями ее генотипа. Технология микроклонального размножения любой культуры объединяет четыре основных этапа: ввод исходной формы в стерильную культуру, собственно микроразмножения, укоренение размноженных побегов, перевод стерильной культуры в условиях открытого грунта. Разработка средств вегетативного размножения элитных растений, гетерозисных гибридов и сортов in vitro позволяет решить проблему быстрого размножения форм, имеющих практическую ценность, а также сохранения материала для использования в рекуррентные селекции.

Микроклональное размножения имеет определенные преимущества по сравнению с традиционными методами размножения: выращивание в искусственных условиях (контролируемых) с меристематических тканей позволяет достичь извлечения вирусов и других патогенных микроорганизмов и получить здоровый посадочный материал; рост растений можно поддерживать в течение многих лет; методом культуры можно размножать формы, не размножаются вегетативно или не дают жизнеспособного семян; можно выбирать генотипы, устойчивые к неблагоприятным условиям выращивания: экстремальные температуры, засуха, засоление и закисление субстрата, угнетающее действие гербицидов и др., а также отбор продуктивных форм в условиях in vitro, скорость и коэффициент размножения достигает 1 :1000000 и дает возможность вдвое-втрое сократить сроки отбора и получения новых растений в селекционных исследованиях.

На современном этапе существует несколько различных детально разработанных методов микроклонального размножения. Различаются они по состоянию исходных клеток и тканей, которые принимают для получения микроклонов. Важнейшим требованием технологии является гарантирование полной стерильности и оптимальных условий для клеточного деления и дифференциации исходной ткани. Затем следует добиться образования большого количества микроклонов и обеспечить их укоренения. Чтобы эффективность микроклонального размножения была высокой, нужно на всех этапах поддерживать оптимальные условия выращивания. Для этого для каждой культуры разрабатывают конкретную методику микроклонального размножения.

Укоренившиеся растения в случае необходимости размещают на депонирование пониженных температур. Это очень важный процесс, поскольку он позволяет задерживать развитие растений и таким образом длительное время сохранять их без пересадки, используя при необходимости. Для переноса стерильных растений в почву надо отбирать среди них здоровые, со светлой, хорошо развитой корневой системой. В репродуцированные культуре тканей видимых морфологических отклонений нет. Генетическая стабильность изолированной культуры наблюдается даже после многократных пассажей, что открывает новые возможности в сохранении генофонда сельскохозяйственных растений. Сохранение и дальнейшее размножение растений в культуре in vitro приобретает большое значение в связи с рекуррентным отбором, поскольку без него невозможно создание гибридов на ЧМ-основе (чоловичостерильний основе). Из выращенных с помощью культуры in vitro маточных растений и корнеплодов получают высококачественные семена. В селекционной практике одновременно с микроклональное размножение растений широко используют метод каллусных культур из эксплантов различных органов, которые являются дополнительным резервом размножения селекционного материала. Он дает возможность практически использовать в селекционном процессе новый тип изменчивости - сомаклональну изменчивость. Каллусных культуры многих сельскохозяйственных растений характеризуются большой нестабильностью. Генетическая вариабельность соматических клеток является одной из причин неоднородности растений, полученных из каллусных тканей. Калусогенезу - это первый этап на пути получения сомаклональних вариантов требует перепрограммирования способов развития клетки. Клетка, переведенная в условия культивирования in vitro, сохраняет свою основную генетическую информацию о целом организм и при наличии соответствующих условий может реализовать ее. Однако физические и химические факторы культивирования, обладают мутагенным действием, а также генетическая гетерогенность соматических клеток эксплантатов создают предпосылки для получения генетически измененных растений. Метод получения сомаклональнои изменчивости позволяет индуцировать не только изменчивость генома, но и плазмоны. В основе феномена сомаклональнои изменчивости лежат сложные процессы структурной и функциональной перестройки генетического аппарата клеток. Используя его, уже получено формы многих сельскохозяйственных культур с ценными признаками. Одной из важных проблем в селекционно-генетических исследованиях перехреснозапильних растений является использование гетерозиса. Основной и наиболее эффективный метод получения стабильных линий является экспериментальная гаплоидия. Исключая многократное самоопыления растений, она позволяет получать гомозиготный материал из обогащенных в генетическом отношении гибридов. Для получения гаплоидных растений используют культуру пыльников, завязи и семенных зачатков. Индукция гаплоидов зависит от генетических свойств растений-доноров, фазы развития семенников, размещение цветоносов на растении и ряда других факторов. Увеличение количества гаплоидов наблюдается в случае изъятия неоплодотворенных семенных зачатков из раскрытых цветков, а также в случае опыления облученным пыльцой донорских растений. Гаплоидов обнаружено во многихсельскохозяйственных культур . Способ получения их в культуре in vitro дает возможность использовать явление гаплоидии не только в генетических исследованиях, но и в практической селекции.

Гетерогенность клеточной популяции суспензионных культур дает возможность получить значительную вариабельность признаков у растений-регенерантов и открывает широкие возможности для генетических и селекционных исследований. Химические компоненты питательной среды и физические условия могут выступать и как мутагенные, экстремальные факторы, вызывающие изменения в нуклеиновых и белковом обменах, структуре, форме и функциях клетки. В данном случае клеточная популяция в условиях культуры in vitro характеризуется физиологической, цитологической и генетической гетерогенностью. Появляются мутанты с измененным морфогенезом, которые можно опереться в селекционно-генетических исследованиях. По клеточной селекции отбор клеточных линий и растений с новыми унаследованными признаками осуществляют на уровне клеток, культивируемых in vitro. Способы культивирования растительных клеток и регенерация из них растений разработаны для многих важных сельскохозяйственных растений. Перечень мутантов с важными сельскохозяйственными признаками, селекцию которых осуществляют на клеточном уровне, очень велик. К ним относятся мутанты, устойчивые к стрессовым факторам, гербицидов, различных заболеваний, засоление и закисление субстрата.

В связи с тем, что возможности совершенствования растений с помощью рекомбинации практически неисчерпаемы, главной задачей является поиск методов управления этим процессом и эффективного выбора ценных генотипов с желаемым комплексом признаков и свойств. Это стало возможным благодаря разработке методов клеточной и генетической инженерии - культуры протопластов и соматической гибридизации и введения генетического материала в растительные клетки и протопласты с помощью трансформируемой ДНК. Первым этапом в этом направлении исследований является разработка метода получения и культивирования жизнеспособных протопластов. Получение жизнеспособных протопластов обусловлено многими факторами, а именно: состав и концентрация ферментов, выбор осмотического раствора, рН-среды, физиологическое состояние ткани, условия перединкубацийнои культивирования. Выделенные протопласты в дальнейшем используют для получения соматических гибридов и соматических цибридов, пересадки органелл, ввод чужеродной информации. Слияние протопластов и соматическая гибридизация позволяют: n скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым способом; n получать асимметричные гибриды, которые несут весь генный набор одного из родителей вместе с несколькими хромосомами (или несколькими генами или только органеллами и цитоплазмой) второго; n создавать систему гибридизации, которая исключает одновременно слияния трех и более родительских клеток; получать растения, гетерозиготные по неядерными генами; n преодолевать ограничения, налагаемые генеративных системами несовместимости; n скрещивать формы, которые невозможно гибридизировать половым способом через аномалии в морфогенезе или гаметогенезе родителей; n гибридизировать клетки, несущие различные эпигенетические программы. Используя метод соматической гибридизации изолированных протопластов, селекционеры выводят гибриды от физиологически несовместимых видов сельскохозяйственных культур.

Главными факторами, которые повышают производительность сельского хозяйства , является совершенствование способов выращивания растений, создание продуктивных сортов, улучшения питания растений и защиту урожая. Большое значение для повышения урожая и его сохранности принадлежит также удобрениям и средствам защиты растений. Генетическая инженерия открывает перед селекцией растений новые перспективы, связанные с возможностью переноса в них генов от бактерий, грибов, экзотических растений и даже человека и животных, что является недостижимым для экспериментального мутагенеза и традиционной селекции, в том числе и генов устойчивости. Революционным свершением в генетической трансформации растений стало обнаружение природного вектора - агробактерий для переноса генов и разработка метода микробомбардування растительных объектов микрочастицами металлов с предварительно нанесенной чужеродной ДНК. Три выдающиеся достижения физиологии растений создали основу для интеграции технологии рекомбинантных ДНК в генно-инженерной биотехнологии растений. Во-первых, открытие фитогормонов, регулирующих рост и развитие растений. Во-вторых, разработка методов культивирования клеток и тканей растений in vitro (эти методы дали возможность выращивать клетки, ткани и целые растения в стерильных условиях и проводить их селекцию на селективных средах). В-третьих, установление феномена тотипотентности соматических растительных клеток, который открыл путь к регенерации из них целых растений.

На сегодня генетическая инженерия сельскохозяйственных растений развивается преимущественно в русле классической селекции. Основные усилия ученых сосредоточены на защите растений от неблагоприятных (биотических и абиотических) факторов, снижении потерь при хранении и улучшении качества продукции растениеводства. В частности, это повышение устойчивости к болезням и вредителям, заморозков или засоления почв, удаления нежелательных компонентов из растительных масел, изменение свойств белка и крахмала в пшеничной муке, улучшения лежкости и вкусовых качеств плодов томата и т.д. Сравнению с традиционной селекцией, основные инструменты которой - скрещивание и отбор, главные преимущества генной инженерии - возможность использования принципиально новых генов, определяющих агрономически важные признаки и новые молекулярно-генетические методы мониторинга трансгенов (молекулярные маркеры генов), которые во много раз ускоряют процесс создания трансгенных растений. Селекционеров привлекает возможность целенаправленного генетического "ремонта" сельскохозяйственных растений. Важным направлением является создание генетически модифицированных растений (ГМР) с признаком мужской стерильности. Кроме того, благодаря генетической модификации, растения могут выполнять не свойственную им ранее роль. Это, например, корнеплоды сахарной свеклы, накапливающих, вместо сахарозы, низкомолекулярные фруктозы, или бананы, которые используют как съедобную вакцину. Благодаря введению генов бактерий, высшие растения приобретают свойства участвовать в разрушении чужеродных органических соединений (ксенобиотиков), которые загрязняют окружающую среду. Выращивание ГМР, устойчивых к широкому спектру болезней и насекомых-вредителей, может существенно снизить, а в дальнейшем свести к минимуму пестицидную нагрузки на окружающую среду. Рост площадей под трансгенными культурами в развитых странах происходит намного интенсивнее, чем в развивающихся странах. На сегодня украинские селекционеры испытывают трансгенные сорта кукурузы, сахарной свеклы и рапса, устойчивые к гербицидам; кукурузы, устойчивой к кукурузного мотылька; и картофеля, устойчивого к колорадскому жуку. Создана система органов с привлечением генетиков, селекционеров, генных инженеров, экологов, медиков, токсикологов, которые оценивают трансгенные сорта для определения потенциального воздействия на человека, животных и окружающую среду. И только после таких экспертиз сорта будут допущены к испытанию с соблюдением всех требований к трансгенных сортов узаконенных в Европейском Союзе. При рассмотрении проблемы возможного влияния трансгенных растений на окружающую среду специалисты, в основном, обсуждают такие важные аспекты: n сконструированы гены будут переданы с пыльцой близкородственными диким видам, и их гибридное потомство приобретет свойства повышенной семенной продуктивности или способности конкурировать с другими растениями; n трансгенные сельскохозяйственные растения станут сорняками для сельского хозяйства и вытеснят растения, растущие рядом; n трансгенные растения станут прямой угрозой человеку, домашним и диким животным (например, ввиду своей токсичности или аллергенности). Еще одним аспектом влияния трансгенных растений на окружающую среду является получение трансгенных растений с лучшей способностью использовать минеральные соединения, что, кроме усиления роста, будет препятствовать их смыванию в грунтовые воды и попадание в источники водоснабжения.

Гарантией против нежелательных последствий генетической модификации растений является законодательное регулирование распространения ГМР и разработка связанных с этим методов оценки экологического риска.

Биотехнология в растениеводстве

Антибиотики для растений. При защите растений от фитопатогенов применяют антибиотики (триходермин и трихоцетин, продуцируемые грибами Trichoderma sp. и Trichotecium roseum). Их используют для борьбы с корневыми гнилями овощных, зерновых и технических культур. (О.А. Алешина, 1982).

Ростовые вещества для растений. Подобно ростовым гормо­нам для животных, биотехнологические методы позволяют по­лучать аналогичные по действию вещества и для растений (гибберелины).

Энтомопатогенные препараты. Традиционно, для биологической защиты растений от насекомых вредителей используют насекомых хищников. В последнее время этот арсенал пополнился грибами, бактериями, вирусами, патогенными для насекомых. Многие виды насекомых-вредителей (тля, колорадский жук, яблоневая плодоножка, озимая совка идр.) восприимчивы к заболеванию, вызываемому грибом Beauveria bussiana. Препарат боверин из конидий грибов сохраняет энтомопатогенность в течение года после обработки почвы.

Вирусные препараты отличаются высокой специфичностью действия, длительным сроком активности (до 10-15 лет), устойчивостью к колебаниям температуры и влажности. Насекомых выращивают в искусственных условиях, заражают вирусом, а из погибших насекомых готовят препараты (например, отечественные препараты вирин-ЭКС - против капустной совки и вирин-ЭНШ - против непарного шелкопряда).

Феромоны. Еще один способ борьбы с насекомыми - обработка участков поля феромонами (половыми аттрактантами насекомых). Такие феромоны получают микробиологическим путем с использо­ванием также химических стадий. Привлеченных феромонами на­секомых собирают на обработанных участках и уничтожают.

Бактериальные удобрения. Биологические удобрения применяют для обогащения почвы азотом. Большое распространение получили препараты нитрагин и азотобактерин - клетки клубеньковых бактерий и азотобактерий. Особенно эффективно обрабатывать этими препаратами семена, которые при прора­стании в симбиозе обеспечивают накопление азотного питания.

Безвирусная рассада. Сельские жители знают, как трудно полу­чить урожай картофеля, не зараженного вирусом. Биотехнология предлагает для этой цели метод культивирования изолированных клеток клубней картофеля. Клетки при этом размножаются в сус­пензии, как дрожжи. Затем выращенные клетки «пересаживают» в искусственный грунт и из каждой клетки вырастает «клубенек» размером не более горошины. Эти горошины высевают в поле как рассаду, из которой нормальным путем вырастает растение карто­феля с множеством клубней. Мешком такой рассады можно засе­ять целое поле. Действительно, получается растение «из пробир­ки».